PCR Master Mix
Un master mix, également connu sous les dénominations premix, super mix ou ready mix, désigne un mélange préconçu disposant de tous les éléments nécessaires à la PCR, prêt à être dispatcher dans les microtubes PCR ou les plaques PCR. Il est composé des éléments récurrents et invariables des réactions de PCR/qPCR. Pour les mélanges disponibles dans le commerce ce sont en règle générale une polymérase ADN ou ARN dépendante, des dNTPS, le MgCl2 et le tampon de réaction. Mais selon le cas, la terminologie master mix peut aussi inclure la matrice ADN/ARN ou des amorces.
L’utilisation d’un mélange de type master mix a pour avantage de diminuer le temps de préparation des réactions et de réduire le nombre d’étapes de pipetage.
Autant la réduction, certes appréciable, de la durée de manipulation, n’a aucun effet substantiel sur la PCR/qPCR, il n’en est pas de même pour la diminution du nombre d’étapes de pipetage. Limiter le nombre d’étapes limite non seulement le risque de contaminations croisées, mais assure également une meilleure reproductibilité des résultats.
Une telle approche permet de facilement multiplier et diversifier les réactions de PCR, tout en conservant un dispositif d’amplification inchangé.
Un master mix se caractérise par les propriétés et la concentration de ses éléments constitutifs.
La polymérase dans le master mix
Les polymérases les plus utilisées sont la Taq polymérase (Thermus aquaticus), la Pfu (Pyrococcus furiosus), la KOD (Thermococcus kodakaraensis) ou des dérivées de celles-ci. Elles ont en commun d’être thermostable, mais diffèrent sur certaines aptitudes, comme par exemple une activité 5’-3’ exonucléase (nick translation), une activité 3’-5’ exonucléase (proofreading) ou encore la processivité.
Les dNTPs (Désoxynucléotides triphosphates)
Les dNTPs qui entre dans la composition du pcr master mix sont les dATP, dCTP, dGTP, et dTTP. La concentration de ceux-ci peut varier entre 50 µM et 500 µM par dNTP, mais dans la plupart des cas une concentration 200 µM par dNTP est recommandé.
Une concentration trop élevée en dNTP peut être à l’origine d’une amplification non spécifique (baisse de la fidélité) alors qu’une concentration trop faible réduit le rendement de la PCR.
La concentration des dNTPs dans le master mix doit être équimolaire. Une variation trop importante entre dNTPs favorise les erreurs d’incorporation et abaisse la fidélité de la polymérase.
D’autre part les dNTPs forment un complexe avec les ions Mg2+ pour devenir le substrat de la polymérase. Augmenter la concentration en dNTP sans augmenter la concentration en Mg2+ réduit la quantité en Mg2+ libre et affecte ainsi l’activité enzymatique.
Mg2+, MgCl2
L’ion magnésium est un cofacteur de la polymérase. Il catalyse la formation de la liaison phosphodiester entre le groupe 3’OH du dernier nucléotide de la chaîne en croissance et le groupe 5’-phosphate du nucléotide à incorporer.
Sans Mg2+ libre l’enzyme est inactive, tandis que la présence d’un excès de magnésium réduit la fidélité de la Taq polymérase.
Les ions Mg2+ interagissent également sur les charges négatives, des groupements phosphates, du brin d’ADN. Ces forces répulsives neutralisées renforcent les liaisons hydrogène et augmentent la température de fusion (Tm), favorisant ainsi la stabilité de l’hybride ADN/ADN. Une concentration trop élevée en Mg2+ peut cependant occasionner une hybridation non spécifique des amorces et augmenter le taux d’erreurs.
D’autres composants (chelatant) comme l’EDTA ou PPi fixent aussi au Mg2+ libre et modifie la concentration de celui-ci dans le milieu réactionnel.
Les ions magnésium sont généralement apportés sous la forme d’une solution MgCl2 au master mix de la PCR. La multiplication des cycles de congélation/décongélation peut cependant favoriser la précipitation du MgCl2 et interférer sur la qualité de la PCR. Mélanger et uniformiser le master mix avant son utilisation est souvent recommandable.
KCl
KCl est sel communément utilisé pour faciliter l’hybridation des amorces et augmenter l’activité enzymatique. A l’instar des ions Mg2+ , les ions K+ neutralisent les charges négatives des groupements phosphate, ce qui renforce les effets des liaisons hydrogène et favorise ainsi l’hybridation des amorces aux brins d’ADN.
Une quantité trop élevée en KCl (> 50 mM) et des effets des liaisons hydrogène trop prononcer peuvent cependant contrarier les phases de dénaturation de la PCR et mener à la production d’amplicons de petite taille voir stopper la PCR.
Une augmentation de la concentration de KCl réduit également la spécificité des amplicons du a l’augmentation de stabilité des amorces- matrice non complémentaires.
Une concentration faible en KCl favorise cependant l’activité enzymatique et la synthèse de fragments longs.
Il est également à noter, lors de la préparation d’un master mix, que les tampons de stockage des polymérases sont susceptibles de contenir du KCl.
(NH4)2SO4
Dans les conditions de la PCR, les ions NH4+, existent en équilibre sous la forme d'ions ammonium (NH4+) et d'ammoniac (NH3 + H+). Les ions ammoniums déstabilisent les liaisons hydrogène faibles telles qu’elles sont présentes dans les mésappariements et favorises ainsi les appariements spécifiques amorces-matrices.
Tris/HCl
Tris-HCl est généralement utilisé comme solution tampon pour stabiliser le master mix à un pH entre 8.3 et 9.0.